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来源:赛默飞电子商务平台
01
目标模板浓度太低
在qPCR 中体现为CT值偏大,复孔重复性不佳。
可能的原因1
基因表达丰度低
优化建议:选择高灵敏度、荧光信号强、更宽动态范围的qPCR试剂对付低丰度模板;
可能的原因2
模板稀释过度
优化建议:提高模板浓度(浓缩),减少模板稀释度(理论上每稀释10倍,CT 值大 3.3);
可能的原因3
模板有降解
优化建议:重新制备模板,注意选择好的RNA纯化Kit,避免RNA降解,优化逆转录条件。
02
扩增效率异常
扩增效率偏离100%±10% 应考虑优化。Ct值出现太晚的潜在原因之一是扩增效率低,导致效率低的原因可能有
可能的原因1
反应条件未优化
优化建议:可以在同一实验中预设不同退火温度,选择Ct值较小且平台期荧光强度高的那个温度;
可能的原因2
存在PCR反应抑制剂
优化建议:一般反应抑制剂多为模板带入,可考虑重新制备模板或者稀释模板从而降低抑制剂水平;选择反应性能强健、更耐受抑制剂 的试剂有助于减少此类因素影响;
可能的原因3
模板扩增区域有复杂二级结构,高GC含量,影响扩增效率
优化建议:同一目标设计多个扩增区域/避开二级结构复杂的区域;选择性能强健耐受性高的预混液,都是可行的解决方法。
03
PCR产物过长影响扩增效率
优化建议:
缩短PCR产物长度,控制在100 bp-150 bp之内
优化建议:
尝试标准的三步扩增提高扩增效率
优化建议:
加长延伸时间使得反应完全,以提高扩增产量
04
无Ct值
可能的原因1
循环数不够
优化建议:一般反应设置为40个,必要时可增加到45个循环;
可能的原因2
信号采集设置不当
优化建议:两步扩增一般将信号采集设置在退火延伸阶段,三步扩增程序应当将信号采集设置在72℃延伸阶段。探针法通常在退火结束时或延伸结束时采集信号。
01
样本重复性差
优化建议:
取材部位/处理方式/时间应严谨地保障一致;选择稳定可靠的试剂盒进行样本制备(如RNA纯化尽量选离心柱,带去除gDNA的)、提取后对RNA的完整度和纯度进行检验,减少样本质量重复性差。
02
技术重复性差
分为复孔重复性差(复孔之间ΔCt<0.5就算重复性良好),不同次跑的板间重复性差。
排查方向有以下——
1
模板浓度低容易出现复孔重复性差,若同时Ct值偏大,可尝试提高模板量。条件允许的话,增加复孔数,弃掉偏差大的值也好办法。
2
加样误差是同时影响孔间和板间重复性的常见原因。良好的操作习惯有助于提高实验重复性,包括:定期校准加样器能减少不同时期之间的加样体积偏差;选择预混液能减少加样误差影响孔间重复性;低吸附耗材能减少试剂挂壁;稳定的操作环境温度,反应前充分混匀样品和试剂和离心除气泡避免影响读数,都有助于减少孔间差异和板间差异。注意仪器上不同位置的孔温度一致性也可能影响孔间一致性。
3
试剂的配液稳定性也值得重视。有时候,配置好的反应板不一定能马上上机,等待时长难以确定,导致板间误差过大——若预混液能保持足够长时间的稳定性,可确定第一个检测板的结果与一个检测板的结果相匹配,同时还能提高工作流程的整体便利性。
4
试剂的批间一致性是影响重复性、实验前后可比较性的重要因素。定量PCR反应体积很小且灵敏度高,不同批次试剂的痕量偏差都可能影响结果稳定。尽量选择同一批次/批号的试剂,选择信誉可靠、批间一致性高的产品,有助于提高实验重复性和结果可比较性。
用SYBR Green可以通过测熔解曲线来分析确认反应产物特异性,熔解曲线是随温度升高DNA双螺旋结构解开程度的曲线:单尖峰提示产物只有一种;多峰则提示有不止一个产物,比如引物二聚体或者非特异扩增。
排查方向有以下——
02
非特异扩增
排查特征:
电泳检测;杂峰Tm值在80℃之后,目标峰之后的多为非特异扩增;
优化建议:
引物设计特异性不好或者模板质量不佳(如含有基因组污染)都可能导致非特异扩增
——建议考虑重新设计引物或者重新制备模板(记得在RNA纯化中用DNase处理降解gDNA)
另外,非特异扩增也可能来自反应退火开始前各种非特异延伸,和“实验室某个角落or空气中的前任、前前任qPCR” DNA污染!带有UDG和dUTP配方设计的预混液可一步消除掉这类非特异产物;再加上抗体暂时封闭酶活的热启动设计,既能防止退火前的非特异反应,又能在退火同时迅速释放酶活,让反应更快速高效率。
Tips:
1
熔解曲线不理想还可尝试两步法,因为二步法扩增特异性高。
2
单峰Tm值在80℃之前考虑没有模板的可能性
3
单峰不尖要考虑可能有大小接近的非特异扩增
4
Mg2+离子浓度超过3mM以上则易形成引物二聚体,选择一管全包条件已优化的预混液就不用考虑
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A
兼顾高灵敏度和高特异性:
保障检测的特异性同时具有更小的Ct 值,低检出限5拷贝
B
高强度荧光信号:
更大的扩增曲线dRn值,更高的平台期荧光信号
C
宽动态范围:
可在跨6个对数级动态范围内进行精准检测,并确定可靠的线性
D
桌面稳定性高:
配置好的qPCR反应体系可以在室温下稳定保存72小时
E
批间一致性高:
生产过程遵循ISO 9001质量管理体系,保障数据的稳定性和重复性
F
抗残留污染:
采用UDG和dUTP配方,杜绝残留扩增产物污染造成的假阳性结果
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