来源：以下文章来源于Cytiva思拓凡 ，作者Li Yafei

2023年2月25日，中华中医药学会发布了2022年中医药十大学术进展。张伯礼院士指出：2022年度中医药十大学术进展主要呈现的价值，就包括“重视新技术新方法在中医药中的应用”。北京大学医学部曾克武教授和屠鹏飞教授与浙江大学、大连医科大学、博奥生物研究团队凭借“新技术助力中药功效科学内涵阐释”共同获选2022年度中医药十大学术进展。

中医药研究者中有广泛的Biacore用户基础，曾克武教授和屠鹏飞教授团队的这一成果里自然也有Biacore的身影。接下来就让小编带您领略Biacore这一现代科技，如何与传统中医药碰撞并融合，从而阐释中药功效科学的内涵。

天然产物中抗肿瘤活性分子

发现及作用机制揭示1

肿瘤免疫微环境（Tumor immune microenvironment ，TIME）调控因子IGF2BP1是一种关键N6 -甲基腺苷 (m6A) 阅读蛋白，识别m6A靶点转录物，被认为是肿瘤治疗的潜在靶点。2022年曾克武教授和屠鹏飞教授团队发表的研究成果中，发现了天然产物葫芦素B通过结合IGF2BP1发挥抗肿瘤作用，并且阐释了作用机制。

以IGF2BP1为出发点，作者首先发现，在小鼠H22荷瘤模型中敲低IGF2BP1，可以通过免疫细胞招募和降低TIME中PD-L1的表达来抑制肝细胞癌的进展。使用Biacore 8K，作者验证了IGF2BP1与甲基化单链RNA（ss-m6A）的强亲和力，达到了18.3 nM。并且发现，IGF2BP1与非甲基化RNA（ss-A）的亲和力则低了13倍。

确定了治疗靶点之后，作者使用Biacore 8K，直接从包含889种化合物的中药天然产物库中筛选能抑制IGF2BP1与其m6A靶点的活性分子。通过合成生物素标记的ss-m6A，作者将RNA直接固定在芯片上，将化合物固定浓度（20 μM）与IGF2BP1预孵育，检测RNA与化合物- IGF2BP1的结合信号，从而直接筛选出具有抑制效果的天然产物（图1）。

图1：Biacore 8K抑制剂筛选方法示意图

通过Biacore 8K的高通量抑制剂筛选实验，作者得到了抑制剂筛选的排序。从图2中可以直观看出，六种具有较强抑制效果的天然产物被发现，其中抑制效果最强的当属葫芦素B（CuB）。在Huh增殖抑制实验中，葫芦素B同样表现出了抑制作用，72h时的IC50达到1.0 uM。

图2：Biacore 8K抑制剂筛选结果

高通量筛选+精确表征，在药物研究的各个阶段都少不了Biacore。在筛选得到葫芦素B后，作者当然同样使用Biacore精确表征了IGF2BP1与葫芦素B的亲和力。结果发现，二者的亲和力达到了1.2 μM，与细胞实验相互印证（图3）。

图3：Biacore精确表征IGF2BP1与CuB的亲和力

葫芦素B又是什么呢？

葫芦素B是从葫芦科等植物中分离得到的一类四环三萜类化合物，具有广泛的药理活性。以葫芦素B为主要成分的葫芦素制剂在临床治疗湿热毒盛所致的迁延性肝炎、肝硬化和原发性肝癌具有确切疗效。中药研究，除了根据已知靶点从天然产物库中找活性分子外，另一个角度则是已知活性分子，寻找作用靶点。在通过抑制剂筛选及表征，从靶点IGF2BP1出发找到活性分子葫芦素B后，作者使用“钩钓”的方法，验证是否能利用葫芦素B“钩”出靶点IGF2BP1。

作者首先合成了葫芦素B分子探针，然后利用pull-down + 质谱的方法从Huh细胞裂解液中成功“钩”到了靶点IGF2BP1，并且在免疫荧光共定位实验中证明了细胞中葫芦素B与IGF2BP1的结合。至此，不论是从靶点出发找活性分子，还是从活性分子出发找靶点，双管齐下，作者明确了葫芦素B与肿瘤免疫微环境调控因子IGF2BP1的直接结合。

为了进一步阐释葫芦素B的抗肿瘤机制，作者研究了IGF2BP1上葫芦素B的结合位置及结合方式。将IGF2BP1的结构域逐一删除后，作者发现只有缺失了C端KH结构域会使IGF2BP1与葫芦素B不能结合。通过质谱、pull-down、BLAST、CD等多种方法，作者最终确定，葫芦素B通过迈克尔加成反应结合在IGF2BP1中KH1−2结构域的Cys253上，并且会引起IGF2BP1的构象变化。

那么葫芦素B又是如何影响IGF2BP1的功能呢？

IGF2BP1本身会与ss-m6A结合，前面作者使用Biacore做了二者抑制剂的高通量筛选，得到了葫芦素B。高通量抑制剂筛选能做，单独的抑制剂表征当然手到擒来。作者设置了Biacore实验来从生化角度上表征葫芦素B的抑制效果。从结果可以看出，随着葫芦素B的浓度逐渐提高，IGF2BP1与ss-m6A的结合信号越来越低（图4）。Biacore结果与RNA pull-down实验一致，明确了葫芦素B可以抑制二者结合。

图4：Biacore实验明确葫芦素B抑制IGF2BP1与ss m6A的结合

后续作者还发现，葫芦素B可以降低与IGF2BP1所结合的mRNA（包括c-MYC、KRAS 等mRNAs）稳定性，在体内通过诱导细胞凋亡，招募免疫细胞到肿瘤微环境，阻断PD-L1的表达，最终表现出明显的抗肿瘤效果（图5）。

图5：文章主要研究路线及作用机制概述

曾克武教授和屠鹏飞教授团队专注于天然活性分子治疗各类型重大疾病的发现及机制阐释，开发了包括分子探针、蛋白芯片2在内的多种靶点“钩钓”技术，多年以来，许多研究成果中均使用了Biacore作为生物分子相互作用检测技术。中国科学院院士陈凯先教授指出：年度的学术进展是中医药学术研究的“指南针”和“风向标”。相信此次研究成果的入选，也将为广大中医药研究者提供更多研究思路，对“积极推进中医药科研和创新，推动传统中医药和现代科学结合”有重要意义。

Biacore

作为现代化的体外分子互作“金标准”，以其超高的灵敏度，超高的数据质量，无分子量检测下限，适用于各类型的天然产物及生物分子研究，在中医药研究者中有广泛的用户基础。Biacore将持续与广大中医药研究者勠力同心，共同推动中医药的现代化研究和应用。

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参考文献：

[1] Liu Y ,  Guo Q ,  Yang H , et al. Allosteric Regulation of IGF2BP1 as a Novel Strategy for the Activation of Tumor Immune Microenvironment[J].  2022.

[2] Zhang et al. Neuroinflammation inhibition by small-molecule targeting USP7 noncatalytic domain for neurodegenerative disease therapy, Sci. Adv. 8, eabo0789 (2022)